早在60 年代人们就开始研究电化学发光, 文献上[16 - 18 ]报导了许多物质的电化学发光, 如多环芳烃类, 酰肼类和联吡啶类化合物等。但最常用于ECLIA 的化学物质是三联吡啶钌[ Ru (bpy) 3 ]2 + ,其结构如下所示: 通过活化“手臂”实现其与核苷酸寡链的3 - 末端或3′和5′- 末端连接, 这种标记物非常稳定, 且由于分子量小(～1000) , 可实现一
分子蛋白标记多个[ Ru (bpy) 3 ]2 + 。 [Ru (bpy) 3 ]2 + 和三丙胺(TPA) 分别在阳极表面氧化成[ Ru ( bpy) 3 ]2 + 和TPA 阳离子自由基(PTA+ ) ·, (PTA+ ) ·迅速脱去一质子形成三丙胺自由基TPA·, TPA·具有强还原性, 从而把[ Ru(bpy) 3 ]3 + 还原为激发态的[ Ru (bpy) 3 ]2 + 3;后者发射一个620nm 的光子回到基态, 再参与下一次电化学发光, 只需0. 01ms 就可发出稳定的光, 300ms达到最高峰, 每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度。另外, 通过电极反应在线制备了不稳定的发光剂[ Ru (bpy) 3 ]3 + 和TPA·,避免了由于化学激发剂不稳定对分析测试的影响。电化学发光免疫分析的突出优点是: (1) 标记物非常稳定, (2) 灵敏度高, (3) 光信号线性好, 动力学范围宽, 超过6 个数量级, (4) 可重复测量,重现性好, (5) 可实现多元检测, (6) 可实现均相免疫分析, (7) 快速,完成一个样品的分析通常只需18min , (8) 可实现全自动化。由于电化学发光免疫分析具有优越性, 是一种很有发展前途的免疫分析法, 日益受到人们的重视。目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测, 尤其是应用于PCR 技术作DNA 探针杂交分析和基因分析有它独特的优点。Bochringer Mannheim 的Elecsys ○R 免疫分析系列商品药盒是采用[ Ru (bpy) 3 ]2 + / TPA ECLIASystem。
电化学发光亦可用于均相免疫分析: 由于抗原- 抗体结合物与游离的非结合物的立体结构不同, 扩散系数差别很大, 因而游离的标记物与结合物在电极作用下, 两者形成电子激发态的机率差别很大, 游离部分相对结合部分可忽略, 因而不需要分离结合部分与非结部分而进行均相免疫分析, 例如据Loranelle L 报道, 用均相电化学发光免疫分析TSH , 检测限为0. 04mIU/ L 。
