1 荧光素酶的来源和性质
荧光素酶是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(fireflyaldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。根据来源生物种类的不
同,可将荧光素酶分为萤火虫荧光素酶(fireflylucifer-ase,FL)和细菌荧光素酶(bacterialluciferase,
BL)[1]。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的
应用中受到限制[2]
。目前,以北美萤火虫(NorthA-mericafirefly)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码产生550个氨基酸的荧光素酶蛋白[3]。近年来,在深海中又发现了海洋腔肠荧光素酶,它所催化的底物海洋腔肠荧光素具有膜通透性,且在哺乳动物细胞中无内源性活力,是保持活细胞完整性最佳的报告基因
2 荧光素酶的发光机制
生物荧光实质是一种化学荧光[3]。BL以脂肪醛(RCHO)为底物,在还原型黄素单核苷酸(FMNH2)及氧的参与下,使脂肪醛在被氧化为脂肪酸的同时放出光子,产生490nm的荧光
[1]
,其化学反应式如下。
RCHO+O2+FMNH2 BL
※ RCOOH+H2O+FMN+光
FL基因来自萤火虫,在Mg2+
、ATP、O2的参与
下,催化D-荧光素(D-luciferin)氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580nm的荧光[1],其化学反应式如下。
D-荧光素+ATP+O2
FL、Mg
2+
※氧化荧光素
+CO2+AMP+Pi+光
这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素
酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰,信噪比也比较高。
3 荧光素酶的检测方法
依赖生物发光特性,利用闪烁计数器(scintillationcounter)对荧光素酶的活性作出定量检测[5]。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测[4]。
4 应用
荧光素酶基因可用于标记基因、细胞和活体动物。标记方法是通过分子生物学克隆技术,将荧光素酶基因插到预期分析的细胞染色体内,通过单克隆细胞技术的筛选,培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。由于现代化实验仪器可以检测到10-19mol的荧光素酶,所以应用该方法的灵敏度很高。
4.1 荧光素酶基因标记基因
荧光素酶基因插入不同基因启动子(promoter)之后,成为该基因表达的报告基因,通过监测报告基因可实现对目标基因表达的监测。Sakoguchi-Okada等
在研究非甾体抗炎药(NSAIDs)塞来考昔的抗结肠癌
作用机制时发现,它可以通过抑制Survivin基因的表达,诱导结肠癌细胞的凋亡。进一步通过PCR方法将Survivin基因启动子相对于5′起始密码子上游的-1594/-18bp区从人类基因组DNA中扩增出来,亚克隆到萤火虫荧光素酶报告载体(pGL3-Basic),合成pGL3-1594(-1594/-18bp)质粒;再通过PCR方法从pGL3-1594(-1594/-18bp)质粒中得到一系列包含Survivin不同长度启动子的质粒(-418/-18、-326/-18、-211/-18、-75/-18、-65/-18、-55/-18、-45/-18和-34/-18bp),将这些质粒分别转染结肠癌细胞18h后,用塞来考昔作用24h,通过监测荧光素酶的活性来了解Survivin的表达情况。结果发现,塞来考昔可明显降低Sur-vivin的表达、诱导肿瘤细胞凋亡,其作用是通过抑制Survivin基因启动子中相对于起始密码子-75/-66bp区的转录活性起作用的。
Jiang等
[7]
用Luciferase法检测胃癌细胞
BGC-823端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子转录活性
时发现,转染hTERT启动子基因的细胞用多西紫杉醇作用0、6、12、24、36和48h后,随着作用时间的延长,Luc/β-gal值逐渐减小,表现出时间依赖性的抑制作用,表明多西紫杉醇抑制端粒酶及其亚基基因的表达是对hTERT启动子活性抑制作用的可能机制之一。
