化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）在近十年来得到了很大发展，与微离子发光酶免疫分析(microparticle luminescence immunoassay, MLIA)、生物发光免
疫分析(bioluminescence immunoassay, BLIA)、增强化学发光分析(enhanced chemiluminescence, EC)和电化学发光分析(electrochemical luminescence, ECL)等相比，以其灵敏度高（可达10-18mol）、检测速度快、操作简便、所用试剂对人体无危害的优点，
成为非放射性免疫分析技术中最具有发展前途的方法之一。
（一）化学发光免疫分析的基本原理
化学发光指化学反应引起的发光现象，当物质吸收化学反应过程中释放的化学能之后，能使自身分子受激发而发光；如在生物体中产生此种能源来自生物活体的发光现象，称为生物发光；若产生发光信号的能量来源于电激发，如从多环芳烃的自由基阴离子上除去一个电子，往往产生激发状态的中间物质，当其回到基态时，将产生光辐射，此种发光称为电化学发光。化学发光反应所发出的光的强度依赖于化学发光反应的速度，而反应速度又依赖于反应物的浓度。因此，通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度，从而进行物质的定性和定量分析。化学发光与荧光的根本区别是形成激发态分子的激发能源不同。荧光是发光物质吸收了激发光后使分子产生发射光，化学发光是化学反应过程中所产生的化学能使分子激发产生的发射光。因此，化学发光反应中反应过程必须产生足够的激发能是产生发光效应的重要
条件。
（二）化学发光兔疫分析中的标记物质
化学发光免疫分析所使用的标记物根据其参与的化学反应不同，可分为三类：①直接参与发光反应的标记物；②以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物；③以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。后两者又称为间接发光。这些标记物应用在不同的发光免疫分析仪器中，了解它们各自特性有助于对不同原理的发光免疫分析在分析测定样品时的特性进行评价
和选择。
1．直接参与发光反应的标记物 待测样品作为反应物，直接参与化学发光反应，如下式。待
测样品A或B，通过反应产生激发态产物C* 当C* 跃迁回到基态时，辐射出光子。
A + B C* + D C* C + h
这类反应的标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应。通常这类物质没有本底发光，在反应中能用于检测低浓度或微量浓度的样品。最常用的标记物主要有吖啶酯类。吖啶酯包括吖啶酯I、吖啶酯II和吖啶酰胺III，是一类发光效率很高的发光剂。吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可与抗体（或抗原）结合，生成具
有化学发光活性强、免疫反应特异性高的标记抗体。
2． 以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物 在这类发光反应中，采用某些酶作为标记
物，这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身又直接参与发光反应。通常用酶标记抗体，检测反应中形成的抗原抗体复合物上的标记酶催化其反应底物后形成的产物，作用于发光物质产生化学发光。该被测样品的含量和发光效率的强弱与酶催化反应后形成产物的量密切相关。在该类方法中最常使用的标记酶有辣根过氧化物酶
（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。
3．以能量传递参与氧化反应的非酶标记物 这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。在这类反应中参与能量传递反应的标记物含量与免疫反应中抗原-抗体复合物形成的量呈正相关，并直接与反应底物产生的光子强度相关，该体系中的发光物质在激发态与基态的活动越强，产生的光子就越多，其发
射光的强度与被检测物的浓度呈正相关。最常用的有三联吡啶钌标记物。
A + B C* + D C* + F F* + E F* F + h （三）在临床生化免疫检测中的应用
无论是化学发光酶免疫测定，微粒子化学发光免疫测定和电化学发光免疫测定，目前都是采用将发光技术与免疫反应和计算机技术完美结合的自动化仪器分析，在这些分析技术中，由于其操作的智能化程度高，敏感度高、特异性强、精密度和准确性均可高于RIA，特别是检测灵敏度高，快速，检测试剂稳定并易于进行质量控制，目前已成为免疫检测广泛采用的分析技术。随着近年来各试剂厂家不断推出许多新开发的诊断试剂盒，使其检测项目涉及面越来越广，可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。 四、
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassny，TRFIA）以镧系元素为标记物，因此又称之为"解离一增强镧系荧光免疫分析"（dissociation－enhancement lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）。它是一种全新的非放射性标记免疫超灵敏度的检测技术。其主要特点是以稀土元素铕（Eu3+）标记抗原或抗体为示踪剂。利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光测量法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了荧光信号测量的特异性和检测方法的灵敏度，最小检出值可达10-17mol/L。具有操作方法简便，标记物制备容易，稳定性好，不污染环境和易于自动化等优点。目前主要用于蛋白质类、酶、
***类激素、甲状腺激素、类固醇激素、药物等的定量检测。
（一） 时间分辨荧光免疫分析原理
通常在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光，如血清蛋白可发射短波长荧光（激发波长为280nm，发射波长为320nm～350nm），而胆红素等化合物可发射较长波长荧光（激发波长为330nm～360nm，发射波长为430nm～470nm）。这些荧光属于非特异荧光，其荧光素寿命短，一般为lns～10ns，最长不超过20ns，因此，普通荧光素发射的荧光与非特异荧光的荧光寿命属于短寿命荧光，在本检测中称背景
荧光。
镧系离子有铕、衫（Sm3+）、镝（Dy3+）等，其荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧
光长3～4个数量级。所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特异性荧光的干扰。另外，较大的Stocks位移（即激发光波长与发射光波长之差）和较窄的发射峰等都增大了检测的信噪比。由于使用解离-增强原理（即镧系元素鳌合物被解离后形成一种处于保护性的胶态分子团中新的高强荧光鳌合
物）使得检测的灵敏度进一步增加，可达5 10-14mol/L。
（二） 时间分辨荧光免疫分析的主要分析方法
1．双位点夹心分析法 以甲胎蛋白（AFP）为例。采用针对AFP分子上不同决定簇的两种单克隆抗体，一种抗体包被在微孔板上，另一种用作制备抗AFP-Eu3+标记物。在微孔板中加入待测样品和标记物，AFP通过其两个结合位点分别与固相和标记物中的抗AFP结合，结合到固相上的抗AFP-Eu3+标记物与AFP含量成正比，洗涤除去游离的标记物；加入增强液，用时间分辨荧光测定仪测定固相上结合标记物的荧光强度，它与AFP浓度呈正比。一系列AFP标准品用于制作标准曲线，通过样品荧光强度可以从标准曲线查出样品AFP含量。 2．竞争分析法 以皮质醇测定为例。Eu3+标记抗皮质醇抗体，微孔板上包被皮质醇。在微孔中加入样品和Eu3+标记物，样品与固相上的皮质醇对有限量抗皮质醇-Eu3+标记物进行竞争性结合，Eu3+标记物与固相结合量与样品皮质醇含量成反比，洗涤除去游离的Eu3+标记物，加入增强液，用时间分辨荧光仪测定荧光强度，荧光强度与样品皮质醇含量呈反比。一系列皮质醇标准品用于制作标准曲线，根据样品荧光强度可以从标准曲线查出皮质醇含量。
（三）时间分辨荧光免疫分析的临床应用
TRFIA技术在实验室应用中已经取得较大的突破，全自动的时间分辨荧光免疫分析仪和多种商品化试剂盒的问世为TRFIA技术的临床应用提供了必要的条件。由于它具有灵敏度高、重复性好、检测线性范围宽、信号稳定和荧光寿命长等优点，使得以前难以定量测定或测定不理想的物质可以方便的检测。蛋白质和多***激素如Ig E、HCG、促黄体生成素、催乳素、促甲状腺素、胰岛素等可以用双位点夹心法测定；半抗原的物质如皮质醇、地高辛、甲状腺素、雌二醇等一般用竞争法测定；另外还可以用于病原体抗原、肿瘤标记物等的测定。由于时间分辨荧光免疫技术优点突出，发展迅速，将逐渐取代放射免疫分析技术。 第五节 其他
检验技术
临床生化实验技术很多，除上述介绍的技术外，还有离心技术、层析技术、生物传感技术和
生物芯片技术等，这里选几种适用的技术作简要介绍。
